pPIC3.5K

pPIC3.5K是一个鉴定多拷贝基因插入到毕赤酵母基因组中的载体。 1. pPIC3.5K载体大小为9004 bp。 2. 在多克隆位点区域，拥有5个单一的限制性酶切位点：BamH I，Snab I，EcoR I，Avr II和Not I。 3.胞内表达。 4.载体构建时，需要包含一个ATG启动子，同时需要加入Kozak序列。 (Cavener and Stuart, 1991; Kozak, 1987; Kozak, 1990) 5. 毕赤酵母中使用HIS4基因筛选。 6.? 将基因插入GS115和KM71的AOX1中，需要使用Sac I线性化质粒(GS115产生的基因型为His+ Mut+，KM71酵母产生的基因型为His+ MutS)。 7. 将基因插入GS115和KM71的HIS4中，需要使用Sal I线性化质粒(GS115产生的基因型为His+ Mut+，KM71酵母产生的基因型为His+ MutS)。 8. 将基因插入GS115的AOX1基因中，也可以使用Bgl II 限制酶线性化质粒，产生的酵母基因型为His+ MutS。

0001 AGATCTAACA TCCAAAGACG AAAGGTTGAA TGAAACCTTT TTGCCATCCG ACATCCACAG 
0061 GTCCATTCTC ACACATAAGT GCCAAACGCA ACAGGAGGGG ATACACTAGC AGCAGACCGT 
0121 TGCAAACGCA GGACCTCCAC TCCTCTTCTC CTCAACACCC ACTTTTGCCA TCGAAAAACC 
0181 AGCCCAGTTA TTGGGCTTGA TTGGAGCTCG CTCATTCCAA TTCCTTCTAT TAGGCTACTA 
0241 ACACCATGAC TTTATTAGCC TGTCTATCCT GGCCCCCCTG GCGAGGTTCA TGTTTGTTTA 
0301 TTTCCGAATG CAACAAGCTC CGCATTACAC CCGAACATCA CTCCAGATGA GGGCTTTCTG 
0361 AGTGTGGGGT CAAATAGTTT CATGTTCCCC AAATGGCCCA AAACTGACAG TTTAAACGCT 
0421 GTCTTGGAAC CTAATATGAC AAAAGCGTGA TCTCATCCAA GATGAACTAA GTTTGGTTCG 
0481 TTGAAATGCT AACGGCCAGT TGGTCAAAAA GAAACTTCCA AAAGTCGCCA TACCGTTTGT 
0541 CTTGTTTGGT ATTGATTGAC GAATGCTCAA AAATAATCTC ATTAATGCTT AGCGCAGTCT 
0601 CTCTATCGCT TCTGAACCCC GGTGCACCTG TGCCGAAACG CAAATGGGGA AACACCCGCT 
0661 TTTTGGATGA TTATGCATTG TCTCCACATT GTATGCTTCC AAGATTCTGG TGGGAATACT 
0721 GCTGATAGCC TAACGTTCAT GATCAAAATT TAACTGTTCT AACCCCTACT TGACAGCAAT 
0781 ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT 
0841 ACTTTCATAA TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA 
0901 CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAGGA TCCTACGTAG AATTCCCTAG 
0961 GGCGGCCGCG AATTAATTCG CCTTAGACAT GACTGTTCCT CAGTTCAAGT TGGGCACTTA 
1021 CGAGAAGACC GGTCTTGCTA GATTCTAATC AAGAGGATGT CAGAATGCCA TTTGCCTGAG 
1081 AGATGCAGGC TTCATTTTTG ATACTTTTTT ATTTGTAACC TATATAGTAT AGGATTTTTT 
1141 TTGTCATTTT GTTTCTTCTC GTACGAGCTT GCTCCTGATC AGCCTATCTC GCAGCTGATG 
1201 AATATCTTGT GGTAGGGGTT TGGGAAAATC ATTCGAGTTT GATGTTTTTC TTGGTATTTC 
1261 CCACTCCTCT TCAGAGTACA GAAGATTAAG TGAGAAGTTC GTTTGTGCAA GCTTATCGAT 
1321 AAGCTTTAAT GCGGTAGTTT ATCACAGTTA AATTGCTAAC GCAGTCAGGC ACCGTGTATG 
1381 AAATCTAACA ATGCGCTCAT CGTCATCCTC GGCACCGTCA CCCTGGATGC TGTAGGCATA 
1441 GGCTTGGTTA TGCCGGTACT GCCGGGCCTC TTGCGGGATA TCGTCCATTC CGACAGCATC 
1501 GCCAGTCACT ATGGCGTGCT GCTAGCGCTA TATGCGTTGA TGCAATTTCT ATGCGCACCC 
1561 GTTCTCGGAG CACTGTCCGA CCGCTTTGGC CGCCGCCCAG TCCTGCTCGC TTCGCTACTT 
1621 GGAGCCACTA TCGACTACGC GATCATGGCG ACCACACCCG TCCTGTGGAT CTATCGAATC 
1681 TAAATGTAAG TTAAAATCTC TAAATAATTA AATAAGTCCC AGTTTCTCCA TACGAACCTT 
1741 AACAGCATTG CGGTGAGCAT CTAGACCTTC AACAGCAGCC AGATCCATCA CTGCTTGGCC 
1801 AATATGTTTC AGTCCCTCAG GAGTTACGTC TTGTGAAGTG ATGAACTTCT GGAAGGTTGC 
1861 AGTGTTAACT CCGCTGTATT GACGGGCATA TCCGTACGTT GGCAAAGTGT GGTTGGTACC 
1921 GGAGGAGTAA TCTCCACAAC TCTCTGGAGA GTAGGCACCA ACAAACACAG ATCCAGCGTG 
1981 TTGTACTTGA TCAACATAAG AAGAAGCATT CTCGATTTGC AGGATCAAGT GTTCAGGAGC 
2041 GTACTGATTG GACATTTCCA AAGCCTGCTC GTAGGTTGCA ACCGATAGGG TTGTAGAGTG 
2101 TGCAATACAC TTGCGTACAA TTTCAACCCT TGGCAACTGC ACAGCTTGGT TGTGAACAGC 
2161 ATCTTCAATT CTGGCAAGCT CCTTGTCTGT CATATCGACA GCCAACAGAA TCACCTGGGA 
2221 ATCAATACCA TGTTCAGCTT GAGACAGAAG GTCTGAGGCA ACGAAATCTG GATCAGCGTA 
2281 TTTATCAGCA ATAACTAGAA CTTCAGAAGG CCCAGCAGGC ATGTCAATAC TACACAGGGC 
2341 TGATGTGTCA TTTTGAACCA TCATCTTGGC AGCAGTAACG AACTGGTTTC CTGGACCAAA 
2401 TATTTTGTCA CACTTAGGAA CAGTTTCTGT TCCGTAAGCC ATAGCAGCTA CTGCCTGGGC 
2461 GCCTCCTGCT AGCACGATAC ACTTAGCACC AACCTTGTGG GCAACGTAGA TGACTTCTGG 
2521 GGTAAGGGTA CCATCCTTCT TAGGTGGAGA TGCAAAAACA ATTTCTTTGC AACCAGCAAC 
2581 TTTGGCAGGA ACACCCAGCA TCAGGGAAGT GGAAGGCAGA ATTGCGGTTC CACCAGGAAT 
2641 ATAGAGGCCA ACTTTCTCAA TAGGTCTTGC AAAACGAGAG CAGACTACAC CAGGGCAAGT 
2701 CTCAACTTGC AACGTCTCCG TTAGTTGAGC TTCATGGAAT TTCCTGACGT TATCTATAGA 
2761 GAGATCAATG GCTCTCTTAA CGTTATCTGG CAATTGCATA AGTTCCTCTG GGAAAGGAGC 
2821 TTCTAACACA GGTGTCTTCA AAGCGACTCC ATCAAACTTG GCAGTTAGTT CTAAAAGGGC 
2881 TTTGTCACCA TTTTGACGAA CATTGTCGAC AATTGGTTTG ACTAATTCCA TAATCTGTTC 
2941 CGTTTTCTGG ATAGGACGAC GAAGGGCATC TTCAATTTCT TGTGAGGAGG CCTTAGAAAC 
3001 GTCAATTTTG CACAATTCAA TACGACCTTC AGAAGGGACT TCTTTAGGTT TGGATTCTTC 
3061 TTTAGGTTGT TCCTTGGTGT ATCCTGGCTT GGCATCTCCT TTCCTTCTAG TGACCTTTAG 
3121 GGACTTCATA TCCAGGTTTC TCTCCACCTC GTCCAACGTC ACACCGTACT TGGCACATCT 
3181 AACTAATGCA AAATAAAATA AGTCAGCACA TTCCCAGGCT ATATCTTCCT TGGATTTAGC 
3241 TTCTGCAAGT TCATCAGCTT CCTCCCTAAT TTTAGCGTTC AACAAAACTT CGTCGTCAAA 
3301 TAACCGTTTG GTATAAGAAC CTTCTGGAGC ATTGCTCTTA CGATCCCACA AGGTGGCTTC 
3361 CATGGCTCTA AGACCCTTTG ATTGGCCAAA ACAGGAAGTG CGTTCCAAGT GACAGAAACC 
3421 AACACCTGTT TGTTCAACCA CAAATTTCAA GCAGTCTCCA TCACAATCCA ATTCGATACC 
3481 CAGCAACTTT TGAGTTGCTC CAGATGTAGC ACCTTTATAC CACAAACCGT GACGACGAGA 
3541 TTGGTAGACT CCAGTTTGTG TCCTTATAGC CTCCGGAATA GACTTTTTGG ACGAGTACAC 
3601 CAGGCCCAAC GAGTAATTAG AAGAGTCAGC CACCAAAGTA GTGAATAGAC CATCGGGGCG 
3661 GTCAGTAGTC AAAGACGCCA ACAAAATTTC ACTGACAGGG AACTTTTTGA CATCTTCAGA 
3721 AAGTTCGTAT TCAGTAGTCA ATTGCCGAGC ATCAATAATG GGGATTATAC CAGAAGCAAC 
3781 AGTGGAAGTC ACATCTACCA ACTTTGCGGT CTCAGAAAAA GCATAAACAG TTCTACTACC 
3841 GCCATTAGTG AAACTTTTCA AATCGCCCAG TGGAGAAGAA AAAGGCACAG CGATACTAGC 
3901 ATTAGCGGGC AAGGATGCAA CTTTATCAAC CAGGGTCCTA TAGATAACCC TAGCGCCTGG 
3961 GATCATCCTT TGGACAACTC TTTCTGCCAA ATCTAGGTCC AAAATCACTT CATTGATACC 
4021 ATTATTGTAC AACTTGAGCA AGTTGTCGAT CAGCTCCTCA AATTGGTCCT CTGTAACGGA 
4081 TGACTCAACT TGCACATTAA CTTGAAGCTC AGTCGATTGA GTGAACTTGA TCAGGTTGTG 
4141 CAGCTGGTCA GCAGCATAGG GAAACACGGC TTTTCCTACC AAACTCAAGG AATTATCAAA 
4201 CTCTGCAACA CTTGCGTATG CAGGTAGCAA GGGAAATGTC ATACTTGAAG TCGGACAGTG 
4261 AGTGTAGTCT TGAGAAATTC TGAAGCCGTA TTTTTATTAT CAGTGAGTCA GTCATCAGGA 
4321 GATCCTCTAC GCCGGACGCA TCGTGGCCGA CCTGCAGGGG GGGGGGGGGC GCTGAGGTCT 
4381 GCCTCGTGAA GAAGGTGTTG CTGACTCATA CCAGGCCTGA ATCGCCCCAT CATCCAGCCA 
4441 GAAAGTGAGG GAGCCACGGT TGATGAGAGC TTTGTTGTAG GTGGACCAGT TGGTGATTTT 
4501 GAACTTTTGC TTTGCCACGG AACGGTCTGC GTTGTCGGGA AGATGCGTGA TCTGATCCTT 
4561 CAACTCAGCA AAAGTTCGAT TTATTCAACA AAGCCGCCGT CCCGTCAAGT CAGCGTAATG 
4621 CTCTGCCAGT GTTACAACCA ATTAACCAAT TCTGATTAGA AAAACTCATC GAGCATCAAA 
4681 TGAAACTGCA ATTTATTCAT ATCAGGATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA AAGCCGTTTC 
4741 TGTAATGAAG GAGAAAACTC ACCGAGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC CTGGTATCGG 
4801 TCTGCGATTC CGACTCGTCC AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA 
4861 AGGTTATCAA GTGAGAAATC ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGC 
4921 TTATGCATTT CTTTCCAGAC TTGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC ATCAAAATCA 
4981 CTCGCATCAA CCAAACCGTT ATTCATTCGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG AAATACGCGA 
5041 TCGCTGTTAA AAGGACAATT ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG GAACACTGCC 
5101 AGCGCATCAA CAATATTTTC ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG GAATGCTGTT 
5161 TTCCCGGGGA TCGCAGTGGT GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT AAAATGCTTG 
5221 ATGGTCGGAA GAGGCATAAA TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC ATCTGTAACA 
5281 TCATTGGCAA CGCTACCTTT GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC GGGCTTCCCA 
5341 TACAATCGAT AGATTGTCGC ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA TTTATACCCA 
5401 TATAAATCAG CATCCATGTT GGAATTTAAT CGCGGCCTCG AGCAAGACGT TTCCCGTTGA 
5461 ATATGGCTCA TAACACCCCT TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT TATTGTTCAT 
5521 GATGATATAT TTTTATCTTG TGCAATGTAA CATCAGAGAT TTTGAGACAC AACGTGGCTT 
5581 TCCCCCCCCC CCCTGCAGGT CGGCATCACC GGCGCCACAG GTGCGGTTGC TGGCGCCTAT 
5641 ATCGCCGACA TCACCGATGG GGAAGATCGG GCTCGCCACT TCGGGCTCAT GAGCGCTTGT 
5701 TTCGGCGTGG GTATGGTGGC AGGCCCCGTG GCCGGGGGAC TGTTGGGCGC CATCTCCTTG 
5761 CATGCACCAT TCCTTGCGGC GGCGGTGCTC AACGGCCTCA ACCTACTACT GGGCTGCTTC 
5821 CTAATGCAGG AGTCGCATAA GGGAGAGCGT CGAGTATCTA TGATTGGAAG TATGGGAATG 
5881 GTGATACCCG CATTCTTCAG TGTCTTGAGG TCTCCTATCA GATTATGCCC AACTAAAGCA 
5941 ACCGGAGGAG GAGATTTCAT GGTAAATTTC TCTGACTTTT GGTCATCAGT AGACTCGAAC 
6001 TGTGAGACTA TCTCGGTTAT GACAGCAGAA ATGTCCTTCT TGGAGACAGT AAATGAAGTC 
6061 CCACCAATAA AGAAATCCTT GTTATCAGGA ACAAACTTCT TGTTTCGAAC TTTTTCGGTG 
6121 CCTTGAACTA TAAAATGTAG AGTGGATATG TCGGGTAGGA ATGGAGCGGG CAAATGCTTA 
6181 CCTTCTGGAC CTTCAAGAGG TATGTAGGGT TTGTAGATAC TGATGCCAAC TTCAGTGACA 
6241 ACGTTGCTAT TTCGTTCAAA CCATTCCGAA TCCAGAGAAA TCAAAGTTGT TTGTCTACTA 
6301 TTGATCCAAG CCAGTGCGGT CTTGAAACTG ACAATAGTGT GCTCGTGTTT TGAGGTCATC 
6361 TTTGTATGAA TAAATCTAGT CTTTGATCTA AATAATCTTG ACGAGCCAAG GCGATAAATA 
6421 CCCAAATCTA AAACTCTTTT AAAACGTTAA AAGGACAAGT ATGTCTGCCT GTATTAAACC 
6481 CCAAATCAGC TCGTAGTCTG ATCCTCATCA ACTTGAGGGG CACTATCTTG TTTTAGAGAA 
6541 ATTTGCGGAG ATGCGATATC GAGAAAAAGG TACGCTGATT TTAAACGTGA AATTTATCTC 
6601 AAGATCTCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC 
6661 CGGAGACGGT CACAGCTTGT CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG 
6721 CGTCAGCGGG TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT AGCGATAGCG 
6781 GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG TGCACCATAT 
6841 GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC CGCATCAGGC GCTCTTCCGC 
6901 TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA 
6961 CTCAAAGGCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG 
7021 AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA 
7081 TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA 
7141 CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC 
7201 TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC 
7261 GCTTTCTCAA TGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT 
7321 GGGCTGTGTG CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG 
7381 TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA CTGGTAACAG 
7441 GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT GGCCTAACTA 
7501 CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG 
7561 AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT 
7621 TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT 
7681 TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG 
7741 ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT 
7801 CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC 
7861 TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT 
7921 AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC 
7981 ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG 
8041 AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG 
8101 AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTG CAGGCATCGT 
8161 GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG 
8221 AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT 
8281 TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC 
8341 TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC 
8401 ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA CACGGGATAA 
8461 TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG 
8521 AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC 
8581 CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG 
8641 GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT 
8701 CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT 
8761 TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC 
8821 ACCTGACGTC TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC 
8881 GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATTAATTCT CATGTTTGAC AGCTTATCAT CGATAAGCTG 
8941 ACTCATGTTG GTATTGTGAA ATAGACGCAG ATCGGGAACA CTGAAAAATA ACAGTTATTA 
9001 TTCG